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小分子量蛋白该如何做好WB?

发布日期:2022-06-15 16:00 浏览次数:

相信经常做WB的实验汪们经常会头疼,郁闷。有些蛋白指标一次就能做成功,而有些指标做无数次都是失败,导致吃不香,睡不下。蛋白分子量过大或过小都不易做,今天我们就来聊下小分子量蛋白如果成功做出WB。

一、上样量

通常Western Blot每孔上样量为30-50μg,80%蛋白在细胞中的含量很低,当蛋白分子量过小时,上样量建议选择50-100μg。毕竟对 于小分子的蛋白来说,在跑电泳时,稍不留心,蛋白就跑没影了。

二、凝胶电泳

1.选择合适胶浓度。分子量小的蛋白,建议配置5%的浓缩胶,分离胶浓度参考下表。
分子量(kDa) 分离胶浓度
X≤10 15%
10<X≤15 13.5%
15<X≤25 12%

2.电泳电压太大会导致跑在最前面的小分子蛋白成锯齿状,建议浓缩胶用80V 30分钟,之后调成100V, 溴酚蓝跑到距胶底1cm以上就停下,不要跑到底,否则目的蛋白可能跑出去了。

三、转膜

1.膜的选择。免疫印迹中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF 膜等。推荐选用 PVDF 膜(聚偏二氟乙烯),因为蛋白质与 PVDF 膜以疏水力结合,从而将亲水部位暴露到液相,使抗体更容易与之结合。
针对不同分子量的蛋白质,PVDF 膜有两种规格:0.45 μm 的膜适合检测 MW > 20 kDa 的蛋白质,0.2 μm 的膜适合检测MW < 20 kDa 的蛋白质,而且0.2 μm 的膜可以有效防止蛋白质在转移过程中直接穿透过膜。PVDF 膜使用之前需要在甲醇中浸泡 5min 后再转入转移液中,PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合。
 
2.转膜方式。对于小分子蛋白,电流太大或时间太长容易转过。转膜采用湿转,条件参考下图。
分子量(kDa) 转膜条件
X≤10 恒流200mA,30min
10 < X≤15 恒流200mA,40min
15< X≤20 恒流200mA,50min
3.转膜前的平衡时间短点,几分钟甚至1min就好。平衡所用的液体及转膜液成份相同,都不要加SDS,效果是天壤之别。

四、转膜后用丽春红染色,测定蛋白丰度。
 
PVDF膜经丽春红染色后,可以检测出样品电泳过程中呈现印迹的大小,通过各个泳道上样品印迹的对比,可以初步判断上样量的准确性。 

五、一抗的稀释比例。
 
通常抗体的说明书上都会给出一定的稀释比例对于分子量过小的蛋白来说,一抗应选择低的稀释比例,这样有助于抗体的结合。 
 
六、显影要把握曝光时间。
 
根据信号的强弱适当调整曝光时间,如果在暗处马上可以看到条带,建议曝光时间在30s-2min内完成,如果信号较弱,第一遍滴加显影液后条带不会很清晰,可以把膜拿出来放一边让它反应一会,然后再放回机器里面,重新滴加显影液显影,效果就会好不少。还有适当延长显影时间,就能获得清晰的条带。

以上就是关于小分子量蛋白WB实验的一些经验建议,希望对还被小分子量蛋白WB折磨的朋友们有帮助。